激光掃描共焦顯微鏡（LSCM）是八十年代問世的一種新型分析儀器，由于其高分辨率，高靈敏度，高放大率等特點(diǎn)，在細(xì)胞水平上能作多種功能測(cè)量和分析，成為分析細(xì)胞學(xué)的重要研究工具，激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測(cè)系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡。它對(duì)活細(xì)胞分層掃描后得到光學(xué)切片，可進(jìn)行細(xì)胞三維重建。測(cè)量分析細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)和熒光強(qiáng)度。利用熒光探針標(biāo)記LSCM可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)和離子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位分析。LSCM可以進(jìn)行顯微手術(shù)，細(xì)胞分選，細(xì)胞胞間通訊和膜的流動(dòng)性等測(cè)量。它的應(yīng)用前景非常廣泛，將為生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的科研工作提供新的手段。
激光掃描共焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM），有時(shí)也被稱為激光掃描細(xì)胞儀（Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速發(fā)展起來的用于分析細(xì)胞學(xué)的新型儀器。LSCM與普通光學(xué)顯微鏡相比優(yōu)點(diǎn)明顯，分辨率、靈敏度、放大率和熒光檢測(cè)信噪比大大提高。對(duì)活細(xì)胞可以做分層掃描后，進(jìn)行三維重建和測(cè)量分析，對(duì)細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化可進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位分析檢測(cè)，可通過熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化比例及動(dòng)態(tài)變化。因此LSCM是細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)，藥物學(xué)及遺傳學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新一代研究工具。
1．LSCM的發(fā)展簡況 Simple development of laser scanning confocal microscope
激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測(cè)系統(tǒng)而形成的新型顯微鏡。1971年美國Davidovits和Egger發(fā)明了以激光為光源的透鏡掃描系統(tǒng)，1978年Sheppard等推出了載物臺(tái)掃描裝置。1979年有了樣品掃描裝置，1980年Koestert等介紹了鏡掃描系統(tǒng)，1983到1986年，Aslund和Carlsson等介紹了雙鏡掃描系統(tǒng)和共軛聚焦成象系統(tǒng)。1984年*臺(tái)LSCM實(shí)用產(chǎn)品問世，十多年來LSCM的應(yīng)用有了飛速發(fā)展。我國在1990年引進(jìn)五臺(tái)LSCM，到了1997年已有了三十多臺(tái)設(shè)備。產(chǎn)品主要來自四家公司，美國的Bio－Rad和Meridian公司，德國的Zeiss和Leica公司。
2．LSCM的基本原理 Principle of laser scanning confocal microscope
普通光學(xué)顯微鏡使用的鹵素?zé)艄庠礊榛旌瞎猓庾V范圍寬，成象時(shí)樣品上每個(gè)照光點(diǎn)均會(huì)受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量，LSCM結(jié)構(gòu)上采用雙針孔（Pinhole）裝置，形成物象共軛的*設(shè)計(jì)，激光經(jīng)物鏡焦平面上針孔形成點(diǎn)光源對(duì)樣品掃描，于測(cè)量透鏡焦平面的探測(cè)針孔處經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測(cè)量光點(diǎn)形成的雜散熒光和樣品不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。這是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)物象共軛，只有物鏡焦平面上的點(diǎn)經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點(diǎn)圖象，掃描后可得到信噪比*的光學(xué)橫斷面，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對(duì)樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測(cè)量，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象的稱為"顯微CT"。
3．LSCM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) Structure of laser scanning confocal microscope
LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。常用計(jì)算機(jī)為奔騰系列，內(nèi)存是64MB，以便于圖像的存取和運(yùn)算，軟件界面多數(shù)為Windows或Windows NT，后者圖象采集效率更高，軟件也可在互聯(lián)網(wǎng)上方便地更新。
3.1 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成象質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細(xì)胞檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)為佳，可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成象質(zhì)量和測(cè)量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場(chǎng)復(fù)消色 差物鏡為好，有利于熒光的采集和成象的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換，濾色片組的選取，載物臺(tái)的移動(dòng)調(diào)節(jié)，焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。多功能顯微鏡以德國的蔡司Zeiss和萊卡Leica的產(chǎn)品為好，也常用日本的尼康Nikon或奧林巴斯Olympus產(chǎn)品。
3.2 掃描裝置LSCM使用的掃描裝置有兩類，臺(tái)掃描系統(tǒng)和鏡掃描系統(tǒng)。現(xiàn)在也有兩者結(jié)合使用的儀器。臺(tái)掃描通過步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)，位移精度可達(dá)0.lμm，能夠有效地消除成象點(diǎn)橫向象差，使樣品信號(hào)強(qiáng)度不受探測(cè)位置的影響，可準(zhǔn)確定位定量地掃描檢測(cè)視野中每一物點(diǎn)的光強(qiáng)度，缺點(diǎn)是載物臺(tái)機(jī)械移動(dòng)、圖象采集速度較慢。鏡掃描有雙鏡掃描和單鏡掃描兩種，通轉(zhuǎn)鏡完成對(duì)樣品的掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍，圖象采集速度大大提高，512×512畫面每秒可達(dá)4幀以上，有利于那些壽命短的離子作熒光測(cè)定，但因光路略有偏轉(zhuǎn)會(huì)對(duì)通光效率和象差有所影響。掃描系統(tǒng)的工作程序由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。
3.3 激光光源
LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。氪氬離子激光器是可見光范圍內(nèi)使用的多光譜激光，發(fā)射波長488nm、568nm和647nm分別為藍(lán)光、綠光和紅光，大功率氬離子激光器是紫外和可見光混合激光器，發(fā)射波長為351－364nm、488nm和514nm分別為紫外光、藍(lán)光和綠光，單個(gè)激光優(yōu)點(diǎn)是安裝方便，光路簡單，但價(jià)格較貴并存在不同激光之間的光譜競(jìng)爭和色差校正問題。多激光器系統(tǒng)在可見光范圍使用氬離子激光器，發(fā)射波長為 488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖激光器發(fā)射波長為633nm的紅光，紫外光選用氬離子激光器，波長為351－364nm。其優(yōu)點(diǎn)是各譜線激光單獨(dú)發(fā)射，不存在譜線競(jìng)爭的干擾，調(diào)節(jié)方便，但光路復(fù)雜，光學(xué)系統(tǒng)共軸準(zhǔn)直調(diào)試要求高。1996年新型雙光子激光器問世，利用雙光子倍頻效應(yīng)，使用可見光激光來代替紫外激光作激發(fā)光源達(dá)到檢測(cè)紫外探針的目的。雙光子激光能使活體細(xì)胞熒光損傷減少，成象質(zhì)量改善，增強(qiáng)對(duì)樣品深層的觀察能力。通過計(jì)算機(jī)控制的聲光調(diào)制器可進(jìn)行各波長光譜之間高速切換以及迅速改變激光光斑、強(qiáng)度和照明時(shí)間。 3.4 檢測(cè)系統(tǒng)
LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng)，光路上要求至少有三個(gè)熒光通道和一個(gè)透射光通道，如有第四熒光通道更好，可對(duì)物體進(jìn)行多譜線激光激發(fā)，樣品發(fā)射熒光的探測(cè)器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器，可以做光子計(jì)數(shù)。每個(gè)PMT前設(shè)置單獨(dú)的針孔，由計(jì)算機(jī)軟件調(diào)節(jié)針孔大小，光路中設(shè)有能自動(dòng)切換的濾色片組，滿足不同測(cè)量的需要。通過在線視頻打印機(jī)或數(shù)字照相機(jī)可以實(shí)時(shí)拷貝圖象和制作幻燈。
4．LSCM的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用 Application of laser scanning confocal microscope in biomedicine
LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數(shù)，提供了光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞生物學(xué)研究上了一個(gè)臺(tái)階。目前我們可以在亞細(xì)胞水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞生物質(zhì)和離子通道的變化，觀察細(xì)胞在生理、病理和藥理情況下對(duì)外界因素作用所產(chǎn)生的快速反應(yīng)，進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位的分析測(cè)量。zui常用的功能是細(xì)胞三維重建，細(xì)胞熒光檢測(cè)和細(xì)胞顯微操作等。
4.1 細(xì)胞的三維重建（3-D Reconstruction）
普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖象結(jié)構(gòu)為多層面的圖象迭加，結(jié)構(gòu)不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，經(jīng)A／D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算法，可作單色圖象處理，雙色圖象處理，組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀察各側(cè)面的表面形態(tài)，也可不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)量細(xì)胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動(dòng)畫效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析，染色體分析，細(xì)胞程序化死亡的觀察，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測(cè)等方面。
4.2 細(xì)胞定量熒光測(cè)定
顯微熒光光度計(jì)由于顯微鏡和激發(fā)光源的限制成象模糊，只能測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為光源，對(duì)細(xì)胞分層掃描，單獨(dú)測(cè)定，經(jīng)積分后能得到細(xì)胞熒光的準(zhǔn)確定量，重復(fù)性。它適于活細(xì)胞的定量分析，可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)溶酶體、線粒體、DNA含量、RNA含量、酶和結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)等物質(zhì)含量和分布，常用于原位分子雜交，腫瘤細(xì)胞識(shí)別，單個(gè)活細(xì)胞水平的DNA損傷及修復(fù)的定量分析。它適于快速高靈敏度測(cè)量，減少光粹滅的影響，在定量免疫熒光測(cè)定方面應(yīng)用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達(dá)的定量分析，監(jiān)測(cè)腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的定位定量信息，監(jiān)測(cè)藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測(cè)自身免疫性疾病的多種抗原及藥物對(duì)肌體免疫功能的作用，監(jiān)測(cè)細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)特征并作定量分析等。細(xì)胞定量熒光測(cè)定可選用單熒光。雙熒光和三熒光方式，能自動(dòng)測(cè)定細(xì)胞面積，平均熒光強(qiáng)度，積分熒光強(qiáng)度及形狀因子等多種參數(shù)。 4.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子PH值和其它離子的動(dòng)態(tài)分析
通過Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium green、SNARF等多種熒光探針，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標(biāo)記并對(duì)它們進(jìn)行比率值和濃度梯度變化測(cè)定。由于細(xì)胞內(nèi)鈣離子為傳遞信息的第二信使，對(duì)細(xì)胞生長分化起著重要作用，通過單標(biāo)記或雙標(biāo)記對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子和其它離子的熒光強(qiáng)度和分布測(cè)定，測(cè)定樣品達(dá)到毫秒級(jí)的快速變化。借助光學(xué)切片功能可以測(cè)量樣品深層的熒光分布以及細(xì)胞光學(xué)切片的生物化學(xué)特性的變化。通過不同時(shí)間段的檢測(cè)可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子的擴(kuò)散速率，了解它對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長因子等刺激的反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)量廣泛用于腫瘤研究、組織胚胎學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域。
4.4 細(xì)胞胞間通訊（Cell Communication）和膜的流動(dòng)性
動(dòng)物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。通過測(cè)量細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用及細(xì)胞內(nèi)鈣離子、pH值等對(duì)縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測(cè)環(huán)境毒素和藥物在細(xì)胞增殖和分化中所起到的作用。選定經(jīng)熒光染色后的細(xì)胞，借助于光漂白作用或光損傷作用使細(xì)胞部分或整體不發(fā)熒光，實(shí)時(shí)觀察檢測(cè)熒光的恢復(fù)過程，可直接反應(yīng)細(xì)胞胞間通訊結(jié)果。
細(xì)胞膜的流動(dòng)性在進(jìn)行膜的磷脂酸組成分析，藥物作用點(diǎn)和藥物作用效應(yīng)，測(cè)定溫度反應(yīng)和物種比較方面有重要作用。細(xì)胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，這種有序的運(yùn)動(dòng)自由度取決于熒光分子周圍的膜流動(dòng)性，所以極性測(cè)量能間接反映細(xì)胞膜的流動(dòng)性。
4.5 熒光光漂白恢復(fù)（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，F(xiàn)RAP）
FRAP是用來測(cè)定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，借助于高強(qiáng)度脈沖激光來照射細(xì)胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光粹滅，該區(qū)域周圍的非粹滅熒光分子會(huì)以一定的速率向受照射區(qū)域擴(kuò)散，這個(gè)擴(kuò)散速率可通過低強(qiáng)度激光掃描探測(cè),因而可得到活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。LSCM可以控制光粹滅作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子擴(kuò)散率和恢復(fù)速率，反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活動(dòng)機(jī)制。廣泛用于研究細(xì)胞骨架構(gòu)成，核膜結(jié)構(gòu)跨膜大分子遷移率，細(xì)胞間通訊等領(lǐng)域。
4.6 籠鎖-解籠鎖測(cè)定（Caged-Uncaged）
這是一種光活化測(cè)定功能。生物活性產(chǎn)物或其它化合物處于籠鎖狀態(tài)時(shí)，其功能封閉，一旦被特異波長的瞬間光照射后，產(chǎn)生光活化解籠鎖，恢復(fù)原有的活性和功能，在細(xì)胞增殖分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。LSCM可以控制籠鎖探針的瞬間光分，選取特定的照射時(shí)間和波長，從而達(dá)到人為控制多種活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時(shí)間和空間作用。它們包括第二信使、核甘酸、神經(jīng)介質(zhì)、鈣離子。
4.7 粘附細(xì)胞分選（Adhered Cell Sort）和顯微手術(shù)（Micro-operation）
采用臺(tái)掃描方式的LSCM，由于激光束固定在顯微鏡的光軸上，可對(duì)載物臺(tái)上的樣品作地定位掃描，從而對(duì)所要選擇的細(xì)胞進(jìn)行分選，Meridian公司的LSCM能夠理想地進(jìn)行這項(xiàng)工作，在不改變細(xì)胞培養(yǎng)周圍環(huán)境，細(xì)胞鋪展程度和生長狀態(tài)情況下進(jìn)行細(xì)胞分選。分選方法有兩種，一種是光刀切割法（Cookie－Cutter），將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，利用高能激光在所選細(xì)胞周圍作八角形切割，只在其間保留所選細(xì)胞，選擇條件取決于特定熒光和細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)，這種分選方法特別適用于選擇數(shù)量較少的細(xì)胞，如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等。第二種方法是激光消除法（Laser Ablation），用高能量激光自動(dòng)殺滅不需要的細(xì)胞，留下完整的活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，這種方式取決于細(xì)胞熒光特性，特別適于對(duì)數(shù)量較多的細(xì)胞選擇。
通過這兩種方式可以總體掃描細(xì)胞群，進(jìn)行細(xì)胞物理和生化特性的選擇。能對(duì)百萬分之一機(jī)率發(fā)生突變的細(xì)胞作篩選，能不改變細(xì)胞類型、形態(tài)和活性而克隆細(xì)胞，能分離細(xì)胞亞群并進(jìn)行定量熒光檢測(cè)，能存儲(chǔ)細(xì)胞位置對(duì)特定細(xì)胞重復(fù)測(cè)定。這種細(xì)胞分選方式效率和度都很高。
借助LSCM我們可以把激光作為光子刀應(yīng)用，來完成細(xì)胞膜瞬間打孔，線粒體、溶酶體和染色體的切割，以及神經(jīng)元突起切割等顯微細(xì)胞外科手術(shù)。
4.8 激光光陷阱技術(shù)（Optical trap）
激光光陷阱技術(shù)又稱為光攝技術(shù)，就是利用光學(xué)梯度力形成的光陷阱，產(chǎn)生具有傳統(tǒng)機(jī)械鑷子挾持和操縱微小物體的功能。當(dāng)微米級(jí)范圍的顆粒落人一個(gè)非均勻光場(chǎng)中，它將趨于特定的平衡位置，如果沒有外界強(qiáng)有力的干擾，物體不會(huì)偏離光學(xué)中心。由于外界作用和粒子自身運(yùn)動(dòng)等原因產(chǎn)生的中心偏離也會(huì)很快恢復(fù)原位，光造成一個(gè)勢(shì)能較低的陷阱區(qū)域，當(dāng)物體的動(dòng)能不能克服周圍勢(shì)壘時(shí)，它將留在陷阱內(nèi)。這種固定是光子動(dòng)量的結(jié)果，與照明強(qiáng)度和波長直接有關(guān)。較大物體比較小的結(jié)構(gòu)需要更多的陷阱能量。光攝可以在保持處在生產(chǎn)環(huán)境中的細(xì)胞仍可與外界溝通的條件下，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式的捕獲與固定，井進(jìn)行地操作，克服了以往單細(xì)胞操作中細(xì)胞難以固定和易產(chǎn)生機(jī)械損傷的弱點(diǎn)。這項(xiàng)新技術(shù)廣泛應(yīng)用于染色體移動(dòng)，細(xì)胞器移動(dòng)，細(xì)胞骨架彈性測(cè)量，細(xì)胞周期和調(diào)控研究及分子動(dòng)力原研究等方面，尤其是在探測(cè)植物細(xì)胞骨架時(shí)，光陷阱是目前能探測(cè)其彈性和流變性的*技術(shù)。
綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點(diǎn)，在細(xì)胞水平上可作多種功能測(cè)量和分析，成為分析細(xì)胞學(xué)的一項(xiàng)重要研究手段。目前LSCM價(jià)格一般報(bào)價(jià)為150萬至300萬左右，用戶基本集中在中科院系統(tǒng)和高等院校，隨著LSCM設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的不斷完善，它在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域里將起到更重要的作用，應(yīng)用前景非常廣泛激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用
應(yīng)用 ：
•  定位、定量
•  三維重組
•  動(dòng)態(tài)測(cè)量
¨ 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+濃度的測(cè)量
¨ 活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（ pH值）的測(cè)量
¨ 自由基的檢測(cè)
¨ 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量 •  細(xì)胞膜電位的測(cè)量
•  熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量
•  籠鎖解籠鎖的測(cè)量
•  熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測(cè)量
•  其他應(yīng)用
一.定位、定量
•  免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、定量
如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與
共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位
•  細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
•  末端原位雜交-fitc + PI
•  熒光原位雜交： 染色體基因定位
•  單細(xì)胞凝膠電泳
•  GFP的表達(dá)
•  游離Ca2+ 的分布與定量

•  定位、定量研究中常用熒光探針
1.Amine-Reactive Probes
與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等
FITC （fluorescent isothiocyanate） BODIPY FL 503/512
異硫氰基熒光素 494/518
TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
PE 藻紅蛋白 565/578 cy3 490/530
cy5 650/690
1）細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白
免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián), 直標(biāo): 一抗+熒光探針
間標(biāo): 二抗+熒光探針
如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針
肌動(dòng)蛋白 Palloidine+熒光探針
2）細(xì)胞膜表面受體
 配體+熒光探針
如: nAchR、mAchR、多巴胺受體（D1,D2）
標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC

2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針
1）線粒體 Mitochondria
Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子性,可檢
測(cè)線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留
時(shí)間短
JC1 線粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光
線粒體膜電位低時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光
可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電
位*探針
Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 ,
穩(wěn)定不漏出
Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, （氧化型）
Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞 2）溶酶體 Lysosome
中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官
為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞
LysoTracker Blue
LysoTracker Red
3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum
DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),
較低濃度標(biāo)記線粒體
4）高爾基體 Golgi apparatus
NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 ¨細(xì)胞器的單克隆抗體
5）細(xì)胞核
PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細(xì)胞
碘化丙啶
EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞
Hochest 33258 （同上）
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細(xì)胞
460/650 RNA
TOTO-1 514/533 DNA   死細(xì)胞
SYTO 活細(xì)胞

3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白（aequoren），該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光 。
將外源基因與GFP DNA 相連, GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá).

GFP主要應(yīng)用: 對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察
如: 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程
中的時(shí)空表達(dá)
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動(dòng)態(tài)觀察該
分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程
GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示
活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的
結(jié)構(gòu)及病理過程

l  定位與定量測(cè)量應(yīng)注意的問題
定位：
1.可以對(duì)圖像進(jìn)行修飾，
2.pinhole 可盡可能的小。
3.確認(rèn)共定位時(shí)要取兩個(gè)通道熒光相互干擾的對(duì)照?qǐng)D像
定量：
1.儀器的各個(gè)條件必須一致
2.必須用原始圖像進(jìn)行定量測(cè)量
3.Pinhole盡可能的大

二.顯微CT與三維重組

光切的層數(shù)：
 VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX

三.動(dòng)態(tài)測(cè)量
l  Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量
1）.游離Ca2+測(cè)量
檢測(cè)游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測(cè)Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-100n M），細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）  熒光探針 激發(fā)波長   發(fā)射波長 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm   525nm 390nM    
Fluo4       506nm    525nm      
Calcium Green-1 507nm   530nm 190nM
Calcium Green-2   507nm   535nm 550nM
Fura red     420/480nm   637nm 140nM
Oregon Green 488   494nm   520nm   20,000nM
Calcium Crimson   583nm   602nm 328nM
Indo-1     356nm 405/458nm 230nM
Fura-2       340/380 476nm 145nM

l  相對(duì) 測(cè)量
          DF/F=（F-Fbase）/（Fbase-FBG）
l  Ca2+濃度測(cè)量
l  單波長公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM

[Ca2+]I =Kd（F-Fmin）/（Fmax-F）

Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度（ MnCl2）
Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度（A23187）
•  測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40）

細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）
·  標(biāo)準(zhǔn)曲線法
根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer（EGTA- Ca2+）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度
·  比例熒光的測(cè)量

.雙波長（比例熒光：ratio） Indo1（360, 420/480）, fura2（340/380, 440）

[Ca2+]I =Kd（R-Rmin）/（Rmax-R）Ff2/Fs2
•  細(xì)胞器的Ca2+測(cè)量
1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測(cè)量
Fluo-3 + TMRM（線粒體熒光探針，紅色）
2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白
水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光
用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化   目前已商品化的探針可檢測(cè)：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量的應(yīng)用

l  鈣的特性
1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍
2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣
明顯升高
3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)”

l  細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用
1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)
2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放
3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)
4．卵子受精
5．細(xì)胞分裂和再生
6．細(xì)胞調(diào)亡
7．細(xì)胞間通訊

8．細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)
9. DNA合成
10. 基因表達(dá)

l  細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病

1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病—胞內(nèi)鈣濃度異常
2．糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內(nèi)鈣濃度增高
3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高
4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）

五.熒光漂白恢復(fù)（FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching）
定義:經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞的某一區(qū)域一旦被高強(qiáng)度的
激光照射后,熒光物質(zhì)的光化學(xué)結(jié)構(gòu)被迫壞,熒光強(qiáng)度
下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強(qiáng)度會(huì)漸漸恢
復(fù), 熒光強(qiáng)度和恢復(fù)的快慢和多少,代表周圍分子擴(kuò)散
的速率, 或分子運(yùn)動(dòng)速度。

R=（I2-I1 /I0-I2）´100%
R-熒光漂白恢復(fù)率：代表分子的運(yùn)動(dòng)速度
應(yīng)用：細(xì)胞間通訊， 細(xì)胞膜流動(dòng)性，蛋白分子的運(yùn)動(dòng)

六.籠鎖解籠鎖的測(cè)量
定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩(wěn)定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團(tuán)修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價(jià)鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為解籠鎖。  

籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經(jīng)遞質(zhì)、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等

七．熒光能量共振轉(zhuǎn)移（ fluorescence Resonance Energy Transfer）
能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。

能量共振轉(zhuǎn)移：分子可以看作為正負(fù)電荷分離的一個(gè)偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動(dòng)，如果其附近有一個(gè)振動(dòng)頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個(gè)分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉(zhuǎn)移到后者，這種能量轉(zhuǎn)移稱為共振轉(zhuǎn)移

熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件
兩個(gè)熒光分子：供體-FL1，受體-FL2
供體與受體的距離在2-7nm
供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致

l  檢測(cè)
以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢 測(cè)到 FL1的發(fā)射光（綠光），發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時(shí)，就可檢測(cè)出
FL1的熒光（綠光）減弱，F(xiàn)L2（紅光）的增強(qiáng)。

l  應(yīng)用：檢測(cè)大分子的相互作用

D 大分子構(gòu)象的改變（蛋白）
例：大分子（亞基）的結(jié)合與分離
D 受體與配體的結(jié)合 · 常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP   八 .其它應(yīng)用
生物材料,例: 細(xì)胞在生物材料中的生長狀態(tài)及分布