摘要：目的建立流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的方法。方法 用Fluo3AM作為鈣指示劑，在有或無細(xì)胞外鈣\[Ca2+\]o存在的條件下，測定靜息和凝血酶激活狀態(tài)下人血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的變化。結(jié)果Fluo3AM標(biāo)記的血小板的平均熒光強(qiáng)度明顯增加。凝血酶使負(fù)載Fluo3AM標(biāo)記的血小板胞漿\[Ca2+\]i明顯增加，且顯示劑量依賴和對\[Ca2+\]o的依賴。結(jié)論凝血酶引起血小板胞漿\[Ca2+\]i增加的來源主要是\[Ca2+\]o，可能也有部分是內(nèi)鈣釋放的參與。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；血小板；鈣；凝血酶
                     
Determinationofthelevelofcytoplasmicfreecalcium
inhumanplaetswithflowcytometry

ZhuangMingming,WenYixin,LiuShaolie,HongXiaopeng

（DepartmentofClinicalLaboratoryofOverseasChineseHospital,Puning515300,China）

ABSTRACT:ObjectiveTosetupamethodtodeterminecytoplasmicfreecalcium\[Ca2+\]iinhumanplaetswithflowcytometry.MethodsAsacalciumindicator,Fluo3AMwasusedtodeterminethechanges,inducedbythrombin,ofthelevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iinpresenceorabsenceofoutsidecalcium\[Ca2+\]o,inordertoelucidatewheretheplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]imainlycomefromanditsroleintheactivityofplaets.ResultsThegeometricmeanoffluorescenceintensityoftheplaet,labeledwithFluo3AM,wasincreasedobviously.Theconcentrationofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iwasincreasedsignificantlybythrombininadoseand\[Ca2+\]odependentmanner.ConclusionTheincreasedlevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]o,inducedbythrombin,mainlycomesfrom\[Ca2+\]oandpartlyfromthereleased\[Ca2+\]oofintraplaetprobably.

KEYWORDS:flowcytometry;plaet;calcium;thrombin

血小板胞漿游離鈣離子\[Ca2+\]i與血小板的許多形態(tài)與功能活動(dòng)有關(guān)，如血小板形態(tài)的改變、聚集、收縮、釋放、分泌等。也與血小板參與的凝血、血液流變性調(diào)節(jié)（如血液黏度、流動(dòng)性等）以及動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展、血管內(nèi)皮活動(dòng)等生理、病理過程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)\[1\]，當(dāng)血小板內(nèi)的\[Ca2+\]i達(dá)到一定的閾值（400nmol/L）就會(huì)發(fā)生釋放反應(yīng)以及可逆性聚集。達(dá)到另一個(gè)閾值（800nmol/L），就會(huì)發(fā)生不可逆性聚集。因此，研究血小板胞漿游離鈣濃度的變化，對闡明血小板參與和調(diào)節(jié)的許多生理生化以及病理過程有重要意義。人們常用鈣熒光指示劑（水母素、Quin2、fura2、Fluro2AM、Fluo3Am）和雙波長熒光光度術(shù)測定細(xì)胞胞漿游離鈣濃度\[2-4\]。本文在建立流式細(xì)胞術(shù)法測定血小板胞漿游離鈣濃度的基礎(chǔ)上，研究了凝血酶誘導(dǎo)的人血小板胞漿游離鈣濃度的變化。

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1血液樣本       

成人血樣，男女兼有，1個(gè)月內(nèi)沒有服用阿司匹林及其他影響血小板功能的藥物。空腹肘靜脈采血，用ACD（ACD∶血=1∶6）抗凝。

1.1.2藥品與試劑       

Fluo3AM（溶于DMSO中）、EGTA（溶于超純度去離子水中）、TritonX100、ADP、凝血酶、小牛血清白蛋白（BSA），均為Sigma（USA）公司產(chǎn)品。ACD（mmol/L：枸櫞酸7,枸櫞酸三鈉85，葡萄糖100）。Hepes緩沖液（mmol/L:NaCl145,KCl5,MgSO41.0,Hepes10,Na2HPO40.5,葡萄糖10,pH7.4）。CaASAHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2和0.94mmol/LASA，pH7.4）。CaHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2，pH7.4）。其他試劑均為市售產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器       

FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國BectonDickinson公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1富血小板血漿（PRP）制備       

抗凝血200×g離心10min，取上清即得富血小板血漿（PRP）。

1.2.2負(fù)載Fluo3AM血小板懸液制備       

取PRP，加入乙酰水楊酸（ASA），使終濃度為0.94mmol/L。輕輕搖勻后800×g離心10min，棄上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes緩沖液1mL，800×g離心10min，棄上清。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes緩沖液重懸血小板，調(diào)節(jié)血小板濃度為2×109/mL。在血小板懸液中加入BSA（終濃度為1.5g/L）和Fluo3AM（4.0μmol/L），輕搖混勻后，在37℃水浴孵育30min后，800×g離心10min，棄上清，用1mLCaHepes緩沖液重復(fù)2次，洗去溶液中多余的Fluo3AM。用Hepes緩沖液重懸血小板，調(diào)節(jié)其濃度為2×106/mL。

1.2.3流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿\[Ca2+\]i        

取負(fù)載Fluo3AM的血小板懸液0.5mL，加入3mL聚乙烯試管中，用CellQuest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，激發(fā)波長為488nm，測定時(shí)，用側(cè)向角（SSC）F1（Fluo3AM）散點(diǎn)圖識(shí)別血小板，用F1直方圖測定平均熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣本獲取10000個(gè)血小板。用CrykiewiczG\[5\]的等比值法公式計(jì)算出血小板胞漿\[Ca2+\]i：\[Ca2+\]i＝Kd×（F－Fmin）/（Fmax－F）式中Kd是Ca2+結(jié)合Fluo3AM的解離常數(shù)，為204nmol/L（37℃）。F為各樣本熒光強(qiáng)度的測定值。Fmax和Fmin分別是zui大熒光強(qiáng)度和zui小熒光強(qiáng)度的測定值。

zui大熒光強(qiáng)度和zui小熒光強(qiáng)度的測定：在各試管中加入60g/LTritonX100、5mmol/LCaCl2，搖勻，靜置10min，用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度，此乃zui大熒光強(qiáng)度。用無鈣的Hepes緩沖液重懸血小板，調(diào)其濃度為2×106/mL，加入25mmol/LEGTA（鈣特異性絡(luò)合劑），搖勻，靜置10min，用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度，此乃zui小熒光強(qiáng)度。

1.2.4凝血酶對血小板胞漿\[Ca2+\]i的影響       

分別研究緩沖液中有鈣和無鈣存在時(shí)，凝血酶對血小板胞漿游離鈣濃度的影響。在CaASAHepes緩沖液和無鈣的Hepes緩沖液中加入凝血酶10、100、1000U/L，用此緩沖液制備負(fù)載Fluo3AM的血小板懸液，用流式細(xì)胞儀測定10000個(gè)血小板的平均熒光強(qiáng)度。為了觀察血小板\[Ca2+\]i隨時(shí)間的變化，分別在加入凝血酶后5、10、15min時(shí)各測定一次。
〖2〗西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）〖3〗第26卷5期〖2〗莊明明，溫奕欣，劉少列，等.流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿游離鈣濃度1.3       統(tǒng)計(jì)學(xué)方法       所用數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS10.0version軟件和tstudenttest法統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.1人血小板胞漿\[Ca2+\]i       

將樣本放置在樣本架上，按下"run"按鈕，開始獲取數(shù)據(jù)，以未標(biāo)記熒光素的樣本為空白對照，并用它調(diào)整陰性區(qū)域的位置，然后依次測定各個(gè)樣本。結(jié)果見圖1。

2.2在外鈣\[Ca2+\]o存在時(shí)凝血酶刺激對人血小板\[Ca2+\]i的影響       

在1mmol/L\[Ca2+\]o存在時(shí)，血小板靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L（n=8），在加入10、100、1000U/L凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i明顯上升，而且有明顯的劑量依賴關(guān)系（表1）。100U/L凝血酶可以使\[Ca2+\]i增加6.4倍。5min時(shí)，血小板\[Ca2+\]i水平較開始加入凝血酶時(shí)降低，10min時(shí)接近于靜息水平。

2.3無外鈣\[Ca2+\]o存在時(shí)人血小板\[Ca2+\]i對凝血酶刺激的反應(yīng)       

在緩沖液中沒有鈣存在的情況下，血小板的\[Ca2+\]i為（29.5±5.6）nmol/L（n=8），緩沖液中凝血酶的水平為10、100、1000U/L時(shí)，血小板\[Ca2+\]i的水平有所上升，但上升的程度明顯小于有外鈣時(shí)。100U/L凝血酶使血小板\[Ca2+\]i增加1.3～1.5倍，并在5min時(shí)恢復(fù)到靜息水平（表1）。表1有或無\[Ca2+\]o時(shí)凝血酶對血小板\[Ca2+\]i的影響（略）
    
3討論

本實(shí)驗(yàn)使用的Fluo3AM為細(xì)胞可通透的細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑，在沒有水解前和（或）無Ca2+存在時(shí)，不顯示熒光，低親和性結(jié)合測量到的瞬間Ca2+峰值比Fura2的高\(yùn)[6\]。TritonX100能增加細(xì)胞膜通透性，提高胞漿內(nèi)Ca2+的濃度，因此，用它測定胞漿內(nèi)Ca2+飽和濃度。EGTA\[Ethylenelycolbis（2aminoethylether）-N,N,N′,N′tetraaceticacid\]是鎂存在時(shí)測定鈣濃度的鰲合劑\[7\]，也是有效的金屬蛋白酶的抑制劑\[8\]，在測定zui小熒光強(qiáng)度時(shí)，用EGTA絡(luò)合胞漿內(nèi)的Ca2+，使胞外的Ca2+濃度zui低。ASA（乙酰水楊酸）是血小板穩(wěn)定劑，可以防止血小板聚集，并保證血小板的功能完善。

血小板靜息\[Ca2+\]i是指沒有任何刺激存在時(shí)，血小板胞漿的游離鈣濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，\[Ca2+\]o為1mmol/L時(shí)，人血小板的靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L；\[Ca2+\]o為0mmol/L時(shí)，其靜息\[Ca2+\]i為（29.5±2.6）nmol/L。在血小板緩沖液中加入凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i迅速上升，而且有明顯的劑量依賴關(guān)系。\[Ca2+\]o為1mmol/L時(shí)，0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板內(nèi)游離鈣濃度分別上升1.58、6.42和10.05倍。另外，\[Ca2+\]o為0mmol/L時(shí)，凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高，但提高的幅度明顯減少，如0.01、0.1、1.0U/mL的凝血酶使血小板內(nèi)游離鈣濃度分別上升0.13、1.3和2.5倍。結(jié)果說明，血小板\[Ca2+\]i的高低與\[Ca2+\]o存在與否有密切關(guān)系。而且在凝血酶的刺激存在時(shí)，\[Ca2+\]i提高的程度也與\[Ca2+\]o有密切關(guān)系。提示血小板內(nèi)鈣的升高主要依賴于\[Ca2+\]o的存在，但不排除內(nèi)鈣釋放的參與\[9,10\]。

流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，大大推進(jìn)了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。結(jié)合熒光探針技術(shù)，對細(xì)胞表面抗原、熒光蛋白表達(dá)、DNA含量及其細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行大量、多參數(shù)檢測與分析，是流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)。我們應(yīng)用Fluo3AM和流式細(xì)胞術(shù)測定血小板\[Ca2+\]i，因?yàn)镕luo3AM很容易進(jìn)入細(xì)胞，熒光強(qiáng)度高，操作方法簡單易行，測量靈敏度高，重復(fù)性好，是研究細(xì)胞內(nèi)\[Ca2+\]i的有效方法。

參考文獻(xiàn)：

[1\]RinkTJ,SmithSW,TsienRY.CytoplasmicfreeCa2+inhumanplaets:Ca2+thresholdandCa2+independentactionforshapechangeandsecretion\[J\].FEBSLett,1982,148（1）:21-26.

[2\]汪鐘，王健美，翁進(jìn).血小板胞漿游離\[Ca2+\]i濃度測定\[A\].張均田主編.現(xiàn)代藥理學(xué)方法\[M\]（下冊）.北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998.1164-1166.

[3\]俞晶，胡文淑.甲基蓮心堿對血小板聚集和胞漿游離鈣離子濃度的影響\[J\].中國毒理學(xué)與藥理學(xué)雜志,1996,10（2）:120-122.

[4\]李建華，孫繼領(lǐng)，高小環(huán).應(yīng)用Fura2AM檢測血小板胞漿游離鈣濃度\[J\].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1996,11（2）:82-83.

[5\]GrynkiewiczG,PoenieM,TsienRY.AnewgenerationofCa2+indicatorswithgreatlyimprovedfluorescenceproperties\[J\].JBiolChem,1985,260（6）:3440-3450.

[6\]KaoJP,HarootunianAT,TsienRY.Photochemicallygeneratedcytosoliccalciumpulsesandtheirdetectionbyfluo3\[J\].JBiolChem,1989,264（12）:8179-8184.

[7\]BirchMachinMA,DawsonAP.EffectsofchelatingagentsontheCa2+stimulatedATPaseofratliverplasmamembranes\[J\].BiochimBiophysActa,1986,855（2）:277-285.

[8\]VidalH,StDenisJF,PainchaudE,etal.Atesttoevaluatetheeffectofindividualcomponentsofethyleneglycolbis（betaaminoethylether）N,N,N',N'tetraaceticacidbuffersonenzymaticactivity\[J\].AnalBiochem,1991,193（1）:135-141.

[9\]HemstapatK,SmithMT,MonteithGR.MeasurementofintracellularCa2+inculturedratembryonichippocampalneuronsusing

afluorescencemicroplatereader:potentialapplicationtobiomolecularscreening\[J\].JPharmacolToxicolMethods,2004,49（2）:

81-87.

[10\]叢玉隆，李綿洋，鄧新立，等.高剪切力活化血小板鈣離子反應(yīng)的研究\[J\].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27（1）:13-16.