Gibco特級胎牛血清使用方法

 在細胞培養(yǎng)過程中，經常加入5%-20%的胎牛血清，常使用的Gibco胎牛血 清濃度是10%。高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續(xù)實驗的結果，我們在實驗中使用10%的Gibco南美 胎牛血清培養(yǎng)293T細胞，效果非常好。但是有些細胞也會使用5%的Gibco FBS或者20%的Gibco胎牛血清，要根據具體 細胞選擇合適的Gibco胎牛血清濃度。

Gibco胎牛血清保存方法

1、需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ - 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超過1個月。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中的有效成分會被破壞，而影響血清質量。如果一次無法用完一瓶,可 將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中。由于血清結冰時體積會增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一 定體積空間,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。
2、一般廠商提供的血清為無菌,無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)液內一起過濾,切勿直接 過濾血清。
3、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室溫,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與成分均一,減少沈淀的發(fā)生。.切勿直接將血清從-20℃進入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質凝集而 出現(xiàn)沉淀。
4、熱滅活是指56℃, 30分鐘加熱已*解凍的血清.加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多,而且還會影響血清的質量.補體 參與反應有:細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞 發(fā)生化學趨化和活化。
5、血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會影響血清本身 的質量.可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理。 顯微鏡下"小黑點":經過熱處理過的血清,沉淀物 的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象"小黑點",常誤認為血清受污染。一般情況下,此小黑 點不會影響細胞生長,但如果懷疑血清質量,則應立即停止使用,更換另一批號的血清。

Gibco胎牛血清使用中遇到的常見問題總結

一、血清滅活問題。

1、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎？

答：不是必須的，看做什么實驗了。

2、問：Gibco胎牛血清滅活是56℃ 30分鐘嗎？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子。 但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補體受體的細胞，如內皮細胞，血清是需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問：我要做滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？

答：進口的一般都已滅活，國產的不一定，還是滅活一下再用較安全。

4、問：我用病毒上清轉染細胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因為血清中可能有些補體和抗體，是不是會影 響轉染？我想未滅活的血清中含些抗體補體可能會和病毒相結合，影響轉染，正確嗎？細胞是單核細胞白血病細胞， 病毒是病毒包裝細胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時，目的是什么？

答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主 結合過程的干擾，一般是2-6小時，根據細胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體滅活 ！這要根據實際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個小時。

5、問：(1)我買的是Gibco北美胎牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培 養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關系嗎？

答：關于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題。大多數(shù)實驗室將血清的熱滅活還是作為 常規(guī)來執(zhí)行，因為有兩個作用，一是滅活補體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實驗者并沒有考慮熱處 理對血清中的生長因子、氨基酸等成分帶來的負面影響。

我在實驗室處理血清的時候，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀 ，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時以 上，肯定也會對里面的蛋白起到破壞作用。下次有機會我做個延長滅活時間的實驗試試，看看到底有多大的影響。熱 滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會有沉淀產生，這常常會被認為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗證到 底有沒有污染，常常又會把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會進一步析出，還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗 ，和革蘭氏染色試驗，非常麻煩。

我看過一份資料，里面提到70%的實驗者認為滅活是理所當然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間， 而時間則從15分鐘到60分鐘不等。其中常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高 ，許多早先認為是熱滅活的原因已經不再成立，只有少數(shù)對血清進行熱滅活的研究者在實驗中證實了這一步驟的有效 性和必要性。有人比較過11個不同細胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細胞，MRC-5) 的生長帶來負面影響，三個細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個細胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細胞生長有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細胞的生長沒 有明顯的促進作用。

你可以摸索一下，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活 ，比較這兩種血清對細胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個過程也就一個星期。同時你還要考慮 血清滅活與否對你后續(xù)的實驗有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產生，這屬正常嗎？

答：正常。

二、血清的保存問題。

1、問：2016年6月到期的GIBCO胎牛血清到2017年5月還能用嗎？

答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著來者，應該還可以，先少用點看看。養(yǎng)細胞系應該沒問題，原代不行。

2、問：請問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室溫下 一晚行嗎？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問：4℃冰箱內保存3個月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用？相關細胞和其它試劑的代價比較高，不敢輕易嘗試。

答：需要長期保存的Gibco胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時間不要超過1個月。

三、血清滅活時溫度問題。

1、問：因為實驗室水浴鍋失控，血清滅活時，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長時間啊？短時間應該可以吧，我有一次加熱了一個多小時，還照樣用。

2、問：我滅活胎牛血清時，用的電磁爐，定在了70℃，本來說調溫度到56℃再放血清的，后來忘了，就把 血清放進去了，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對血清有沒有影響？

 答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時間則從15分鐘到60分鐘不等，其中常用的手法是56℃ 熱處理30分鐘。看看你養(yǎng)的細胞是什么，一般的話估計問題不大，要是很珍貴的細胞還是慎重一點啊。熱滅活目的是 為了去除血清中補體等對熱敏感的物質， 在對補體滅活以外，熱處理同時也對血清中可能存在的支原體具有滅活作 用。現(xiàn)在好像不主張熱滅活，熱滅活經常給血清產品帶來負面影響，對血清的加熱經常導致血清中沉淀的產生，此外 ，有研究結果證實熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細胞的培養(yǎng)，文獻上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有 。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔心免疫排斥之類，但是我查了些資料后，應該不會(我覺得)。但是我又不 能夠TRY。因為細胞因子確實太貴了，所以咨詢一下。謝謝！

答：你還是照文獻的做。除非你系列實驗證明你用代用品的結果與文獻的相同(你還是要用到文獻的試劑) 。細胞培養(yǎng)的影響因素很多，特別是培養(yǎng)基的成分。

五、血清的制備方法問題。

1、問：我的實驗需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細胞，有沒有人知道用于培養(yǎng)細胞的血清需要怎樣的制備 過程？

答：自己制備血清當心污染啊。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行。

2、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜，離心，取上清，在無菌過濾，也可滅活，然后分裝凍存，用 時再配。

3、問：如果滅活會不會對血清中的一些因子有損傷？

答：加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺， 激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。滅活 一般不會對血清中的一些因子損傷的。

六、心肌細胞原代培養(yǎng)時血清的使用問題。

1、問：在進行心肌細胞原代培養(yǎng)時，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用，我現(xiàn)在使用的是含血清 10%的培養(yǎng)液，但近日看北醫(yī)一個細胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn)，有用1%血清培養(yǎng)液進行中止消化的，想問一下，1%的是否可 以，效果是否有保證？這樣確實能節(jié)省不少血清的。

答：關于心肌細胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清*培養(yǎng)基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細胞元代培養(yǎng)就不行。 10%的FBS* 培養(yǎng)基效果都不太好，開始心肌細胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS，20%左右，但這就有出現(xiàn)另一個問題，在FBS*培 養(yǎng)基中，成纖維細胞呈優(yōu)勢細胞，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長，純化心肌細胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白質如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

(3)元代心肌細胞培養(yǎng)的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS，后逐漸遞減為無血清的 DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、問：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細胞培養(yǎng)中啊， 難道在消化時終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU只用到48小時就不用了，因為擔心其損傷太大，可以持續(xù) 用多久呢？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的，沒有用brdu，心肌細胞還是比 較多和穩(wěn)定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會有搏動。

七、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題。

1、問：細胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個公司的產品比較好呢？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或 sigma出品的差別大嗎？

答：如果是長得非常快得細胞如pa317，293，c6等惡性腫瘤細胞，一般得國產血清就可以，如果是原代培養(yǎng)的細胞，還是應用胎牛血清或類標準胎牛血清，Hyclone公司血清的質量不如GIBCO(同類血清)。國產的杭州四季 青和甘肅民海（中美和資）不錯。有些細胞(如：sf9，293還有其他一些元代細胞)，用Gibco的比其他兩種好很多， 會大大加速試驗進度。對于其他一些細胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 還要看產地。

2、問：近期要訂一瓶胎牛血清，實驗室之前都在用小牛血清，沒有買過胎牛血清。請問哪個公司的好一些 ？問過試劑公司，有兩種：一種是PAA的(分普通級和優(yōu)級)，一種是Hyclone的(只有普通級，而且是新西蘭產的)。 試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級的，但看好多文獻都用Hyclone的，公司說是因為現(xiàn)在Hyclone的都不是美國進口的了。請 問用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯，要是不放心國產的，那就買進口的。進口的好多公司都有，新西蘭產的效果一般 。Hyclone和Gibco的都還可以。民海的似乎比四季青的要好些。復蒙的感覺也不錯。

3、問：四季青“無噬菌體、低內毒素胎牛血清”與“無支原體胎牛血清”的區(qū)別 ？培養(yǎng)腫瘤傳代細胞用哪一個比較好些？

答：用無支原體胎牛血清就可以啦。

4、問：SKBR-3細胞培養(yǎng)用哪種型號的1640培養(yǎng)基及胎牛血清？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以買含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。 

八、牛血清污染噬菌體的問題。

1、問：有誰知道小牛血清制造過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體？

2、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體，它對細胞培養(yǎng)到底有什么影響？

暫無回答。

九、培養(yǎng)基血清濃度問題。

問：在1640里加血清時加多了，90ml里加了20ml血清，約為18%，以前都是加10ml的，查了網上多建議用 10%-15%，有關系嗎？

答：我認為一般來說血清濃度的較大波動對細胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調成10%。血清濃度大 當然細胞狀態(tài)感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細胞的基因表達譜，影響后續(xù)實驗的結果。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙 癌細胞很好。

十、問：MTT加藥的時候加不加血清？加藥時要用無血清的培養(yǎng)基嗎？

答：我的藥就是用含血清的培養(yǎng)基稀釋的，不含血清的培養(yǎng)基對細胞有毒性或抑制作用，無形中對細胞造 了一個serum-free的模型，細胞在提內本來就是有血清供應，如果該藥物都不能對抗，那該藥物就沒有什么臨床價 值了，這是我的理解。

十一、PC12細胞培養(yǎng)所用血清問題。

問：我正準備購買上海細胞所的未分化的PC12細胞，需要滅活的馬血清，可現(xiàn)在買血清很困難，好像是海關有封鎖，代理商這么說的，我原定購買的Gibco的horse surum，現(xiàn)在無法買到了，好容易找到一個目前可以進血清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個。。

十二、AB血清的制備問題。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細胞的培養(yǎng)。謝謝大家給點建議。人的血，來之不易啊。

答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒有抗A型抗原抗體，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時將采集的 血液注入試管中，待血液凝固后離心分離血清。可將采集的血液放在37℃水浴箱中促進血液凝固，減少凝固時間。離 心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計算，因為紅細胞占總血液的50%左右。當然整個過程要注意無菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清內是否含糖？

問：我想做糖誘導細胞凋亡的試驗。細胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖對我 實驗的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大。今天打電話問GIBCO公司的技術顧問，回答我糖濃度少于5μg/ml，因此基本 可認為是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢 測人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎？(另起茶水驗尿事件？)檢驗科沒有給我回答。

答：應該是不含糖的。請參照gibco的網站： 第五頁我做了個記號。直接點擊鏈接就可以看到它的說明書頁面。我想我們肯定要以公司的說明書為準。至于為什么檢驗科測起來有誤差，我想 可能是樣本不一樣，需要用標志品矯正有關。具體需要檢驗科的戰(zhàn)友解釋了。

十四、血清或培養(yǎng)基產生了顏色或沉淀的問題：

1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能 再用？血清的生產日期是2006年7月(現(xiàn)在是2007年6月11日)。

答：應該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了。血清中沉淀 物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。 若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起 過濾。

2、問：我用MTT法測細胞的增殖，用DMSO裂解細胞，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養(yǎng)基，由于沒有離板子的離心機，所以沒有去除培養(yǎng)基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有 看到有這種情況。該怎么解決？

答：為什么要用離心機離心呢？難倒你養(yǎng)的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO 即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測細胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應該很大！有時不一 定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時間或以及其他成分有關！

3、問：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結果使得前面的幾管是清亮的，后面就 帶有棕色的，不知有沒有影響？估計有什么影響？前面的成分好還是棕色的成分好啊？

答：肯定有。還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會出現(xiàn)棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因為紅蛋白的含量高些的緣故吧。

問：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒有加到培養(yǎng)基里，而是放在冰箱里，那下次 可以直接用嗎？還是再次滅活啊？

答：當然可以，如果多的話，分裝后放在－20℃，下次用時再解凍，也不用再滅活。用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃。分裝時還要注意不要裝得太滿，以免溢出污染。

十五、污染和過濾的問題。

1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對血清性質有多大影響？有 做過的么？

答：可以過濾的，血清當出廠時都是0.22μm或0.1μm過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩 ，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會變渾濁的，如果還是澄清的就說明沒有問題的。實驗室中血清 很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾。我們實驗室制備培養(yǎng)基時，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備1-2瓶 培養(yǎng)基，一個濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中，使 用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2、問：我懷疑我用的*1640培養(yǎng)液被污染了，準備重新過濾消毒，過濾后是否需要補充胎牛血清？如需 又如何補充？

答：*1640培養(yǎng)液被污染了，如果是支原體的話，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜。我們用1640液 ，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現(xiàn)用現(xiàn)配因為血清比1640要貴，如果你想過濾的話，建議你加原比例血清，因為血清不會很容易通過濾膜。主要的還是找到可能污染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎？

答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經污染，那么細菌污染的可能性會較小了。一般的過濾除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、問：我準備把使用的*1640培養(yǎng)液重新過濾一遍，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾 后是否還需要補充胎牛血清？如需又如何補充？

答：可以透過，但是隨著液體量的增多會很慢，如果不加壓會比較麻煩，還有用低蛋白吸附的，不然損失是比較大的。

十六、問：懸浮細胞培養(yǎng)時能否加血清？如果加了會有什么結果？為什么懸浮細胞培養(yǎng)時就不能加血清？

答：血清是細胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一，對細胞生長有廣泛影響。在細胞培養(yǎng)時，我們通常會加入 10%的血清。血清的質量對細胞培養(yǎng)的成功至關重要。一般說來，牛血清包括以下成分：生長因子(如激素，白細胞介 素等)，他們可以促進細胞生長；貼附因子，他們可以促進細胞的貼壁，往往只有細胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細胞 除外)；蛋白質(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營養(yǎng)物質，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物 質。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷。因此，無 論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是*的。除非因實驗要求無血清培養(yǎng)時，例如：為使細胞同步化時，我們會 采用無血清培養(yǎng)的。單純的說懸浮細胞培養(yǎng)不能加血清就沒有太多的道理了。

十七、關于中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少？

答：做了很久的試驗，真的沒有想過胰酶和血清的對應關系。不過細想下來，這個應該也沒有固定的比值 。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關系？我們消化細胞的時候，如果是傳代， 細胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中 止消化的。不會存在繼續(xù)消化的事情。如果是從組織上消化細胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進行中止，而且加的 很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應該是足夠的。當然全培是2，一般我養(yǎng)細胞的時候，會用國產的比 較便宜的血清配制全培，專門用于中止消化，這樣有幾個好處：一是中止消化的效果應該好于hanks液吧，再是也有 利于維持細胞活性。而且這部分液體會被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會心疼。而養(yǎng)細胞的時候用好血清。個人 觀點，僅供參考。

十八、血清中的懸浮物問題。

1、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞瓶中背景有許多的小黑點，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以為是膠原 蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有懸浮的顆粒狀物質(不多)，于是放在鏡 下觀察，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀察，肉眼可見5、6個白色小小球狀的物質，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知 什么物質的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標簽上寫已經經過2μm濾膜過濾處理。根據上述培養(yǎng)液的情 況，是否說明培養(yǎng)液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應該看到雜物，哪怕是極少量的？根據上述血清的 描述，是不是說明血清也存在問題，還能用嗎？補充：細胞培養(yǎng)以來生長狀態(tài)就不好。買血清的時候廠家說明不用滅 活，所以未滅活。

答：(1)血清應該-20℃保存，解凍血清時，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變 的溫度太大實驗顯示非常容易產生沉淀物。

(2)血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 在血清解凍后，也會存在于血清中，亦可造成沉淀物。

(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于4℃時，請勿超過一個月，儲存 在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。

(4)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實驗用品和無菌操作的問題。

(6)細菌病毒、衣原體、黑膠蟲污染也很常見，如果細胞死的太多，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2、問：今天在配培養(yǎng)液時，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么， 問了實驗室的學長，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助園子的各位達人，這可能是血清出了什么問題 ？我的血清用了一個月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時Votex不夠，當時是清亮的，但過一段時間會析出來；(2)真菌污染。

十九、更換無血清培養(yǎng)基后細胞大量死亡的問題。

問：我使用Lipofectamine2000轉染成骨細胞，在轉染前要換上無血清的培養(yǎng)基。本來條件模的好好的，轉 染效率也可以接受。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細胞在有血清的培養(yǎng)基中長的好好的，一換無血清的培養(yǎng)基就死 亡。大概4個小時就能看到較多的細胞飄起來。但是原來我換無血清培養(yǎng)基，就算放那里10個小時都是沒問題的啊。 已經換了不同批次的培養(yǎng)基，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應補加谷氨酰胺，或者重新配液，轉染時應不含抗生素。

(2)確認操作方法和環(huán)境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質體的毒性很大，如果有質粒參與對細胞損傷更大，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過，對細胞更大，假期冰箱是否斷過電。

(4)培養(yǎng)箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、*培養(yǎng)液的相關定義。

問：“*培養(yǎng)液一詞”，是指加了血清的培養(yǎng)液嗎？我在做含藥血清的實驗，涉及到血清添 加量的問題。所以想弄明白文中所指的“*培養(yǎng)液”是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過濾除菌。不*培養(yǎng)液是指不含有血清的原液，其他成分已補充。*培養(yǎng)液是指 不*培養(yǎng)液加入血清后稱*培養(yǎng)液。

二十一、血清相關知識總結。

使用胎牛血清的注意事項：

血清是細胞培養(yǎng)中重要的元素之一。下面是實驗室里常會遇到的問題，僅供大家參考：

1、保存血清的方法：

建議血清應保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶 ，建議您無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀龋俜呕乩鋬觥?/span>

2、如何解凍血清才不會使產品質量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是， 溶解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。

3、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影 響血清本身的質量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培 養(yǎng)基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ， 30 分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活化，而補體所參與的 反應有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化 和激活。

5、關于胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎？

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生 長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。 而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點” ，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是 微生物的分裂擴增。

因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時間，更確保 您血清的質量！

6、血清相關知識：

如何避免沉淀物的產生？

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃)，實驗顯示非常容易產生沉淀物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會 因此受到損害，而影響血清的質量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖 晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。